种子蛋白电泳技术

【摘要】：种子蛋白电泳是指通过特定的电泳方法对种子蛋白进行分离和鉴别的一种技术，最常用的是酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳（A-PAGE）和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。聚丙烯酰胺凝胶电泳作为一种高分辨率的分析鉴定技术，在蛋白质、多肽、核酸等生物大分子的分析中一直广泛使用，通过种子蛋白电泳获得的指纹图谱在测定良种质量（真伪、纯度）防止伪劣种子流入，保护我国名、优、特种质资源及育成的知识产权和育种家们的权益等方面，均具有重要意义。

【关键词】：种子蛋白；凝胶电泳

1种子蛋白质的分类

种子蛋白质分为两大类：贮藏蛋白质和“家政”蛋白质。贮藏蛋白质是种子蛋白质的主要成份，它在种子形成发育时期大量合成和积累；在种子萌发时，它又很快被水解并为幼苗早期生长提供还原性的氮源。“家政”蛋白质在种子中的含量较少，但对于维持种子的正常代谢活动却是必不可少的。通常根据蛋白质的溶解性，将种子贮藏蛋白质分为4类：溶于水的清蛋白、溶于盐溶液的球蛋白、溶于醇溶液的醇溶蛋白和溶于酸或碱的谷蛋白。

2电泳技术简介

电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。

电泳按其分离的原理不同可分为：早期的自由界面电泳、应用最广泛的区带电泳、等速电泳、等电聚焦电泳等。作为品种鉴定的一种快速有效的方法，在20世纪70年代初期，许多科学家和种子分析人员就开始通过能够鉴别生物个体之间差异的电泳图谱测定品种间的遗传差异。最初采用同工酶电泳技术，80年代以后电泳方法不断改进才逐渐采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，特别是蛋白质电泳因其具有的良好稳定性和重复性显示出巨大的使用价值。蛋白质电泳指纹图谱包括同工酶和贮藏蛋白，这些蛋白的组成由遗传决定，几乎不受影响，其组分差别反映出基因型的不同，且产生的指纹图谱分辨率高、重复性好，因而被作为品种鉴别与分类的“指纹”得到广泛应用。

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3聚丙烯酰胺凝胶电泳技术

聚丙烯酰胺凝胶电泳是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鉴定技术，是生化物质的最高纯度的标准分析鉴定方法，至今仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段。种子蛋白电泳就是采用聚丙烯酰胺做为支持介质的电泳技术。

聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制，可以随意控制胶浓度“T”和交联度“C”得到不同的有效孔径，用于分离不同分子量的生物大分子，大大增加了凝胶的分离范围。同时聚丙烯酰胺凝胶还具有化学惰性好不会出现“电渗”、电泳分离的重复性好、胶体透明度高易于拍照、强度好易于保存、无紫外吸收等优点，得到了广泛的应用目前尚无更好的支持介质能够取代它。

种子蛋白大多带正电荷，因而种子蛋白电泳过程中常采用酸性不连续性聚丙烯酰胺凝胶电泳（A-PAGE）的方法，让带电基团向正极泳动，通过凝胶的浓缩效应、电荷效应、分子筛效应，对蛋白进行分离。也可采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），SDS-PAGE是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS是一种阴离子去垢剂，可与蛋白质结合，形成SDS -蛋白质复合物。由于SDS带有大量负电荷，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖，消除了蛋白质分子之间电荷差异。因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小，此法常用于蛋白质分子量的测定。

对种子蛋白进行电泳分离主要目的是为了鉴别种子的真实性和品种纯度，具体方法可参考标准根据实际情况稍做改进。酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳中常采用甲酸盐缓冲体系和乳酸盐缓冲体系，分离胶的pH值在2.7-3.2之间，电极缓冲液的pH值在3.25-3.65之间，慢离子多为甘氨酸浓度在0.040~0.053 mol/L之间。至于凝胶浓度的确定，不同的贮藏蛋白分子量大小不同所需的凝胶孔径也有差异，应在实验中调整胶浓度大小通过电泳结果选择合适的浓度。

品种纯度是农作物种子质量指标中最关键的一项，是对种子质量进行分级的唯一指标。随着草坪业的发展速度日益加快，草坪种子目前以成为世界仅次于禾谷类种子的第二大交易种子。为防止伪劣种子流入同时保护优良种质防止良种退化，维护育种家们的知识产权和权益等方面，无论是在农作物还是在草坪草都需要进行品种鉴定，种子蛋白电泳技术一直在品种鉴定工作中发挥这重要的作用，具有重要的意义。

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