近年来，猪疫病病原监测将采用猪口腔液采集新技术。采样技术将从传统的机体损伤性逐渐向非应激性采集方式转变。
以往病原监测采集的样品主要以血液、扁桃体、肺和淋巴结等为主。扁桃体和血液样品的采集需在猪活体上进行，采样难度大，易给猪群造成较大应激及不良反应，在实际采样工作中常遇到养殖场户不配合情况。而肺和淋巴结等组织往往需从屠宰场采集，样品难以准确反映本地猪群疫病管理的实际情况。而猪口腔液样品采集技术操作简易、成本低廉，适合大面积推广，对猪只无损伤，更加符合动物福利原则。
所谓口腔液，即是指猪口腔中的唾液和血清渗出液的混合液体，血清渗出液是通过口腔黏膜和口腔黏膜上的齿龈沟和毛细血管进入口腔。业已证实，口腔液具有广泛的生物学功能，口腔液样品既可用作抗体检测，又可用于PCR检测抗原，可替代血清样品，为猪群传染病监测提供有效的技术手段，口蹄疫病毒、非洲猪瘟病毒、经典猪瘟病毒、流感病毒、蓝耳病病毒、以及还有其他的一些病原体都可以采用口腔液进行检测。虽然口腔液样品主要采自于断奶猪和生长育肥猪，但也适用于后备种猪、生产母猪和生产公猪。
1.猪口腔液采集方法
将100％纯棉绳悬挂于猪栏的干净区域，直径1.3cm的绳子用于保育猪口腔液采集，直径1.6cm的绳子则用于生长育肥猪和生产公母猪。绳子上端打结，并做好固定。悬挂处应远离饲槽和猪排便区，悬挂高度应高于猪身但保证猪能接近和啃咬，任猪咀嚼，30min后收取棉绳，刮取和挤压上面的口腔液至塑料板或玻璃皿中，再将口腔液吸取至试管中备用，理论上至少能收集到4mL的采样量，但一般认为≥1mL为有效采集量。如果口腔液样品比较干净，则无需再作处理；如果样品混有其它颗粒物，则低速离心10min即可。
2.口腔液检测的注意事项
(1)口腔液检测并非疫病诊断或检测标准中的程序，仅用于猪群中循环抗体或抗原的检测和评估。
(2)口腔液样品不要混样。
(3)棉绳吸收性最好，合成纤维绳则效果稍差。
(4)有的猪群第一次可能不太情愿啃咬绳子，可先将绳子供其玩弄，或在绳子上喷洒糖溶液，一旦习惯养成，而后再采集就方便了。
(5)猪上午活动敏捷，因此宜于在该时间段采样，午后则可能花费时间较长。
(6)绳子的悬挂高度应与猪肩胛部平。
(7)猪有喜新厌旧的心理，已经使用的绳子不宜再用。
猪口腔液采集新技术一个样本可覆盖多猪只，可同时检测多种疫病病原，减少人力物力的耗费，大幅提高疫病检测效率，能够更加全面地掌握猪群的整体状况。口腔液采集，方法简便，易学易用，速度快，应急小，费用低，不需要专门器材和特殊的技巧训练，并可减少应激，改善动物福利，有助于猪群生长性能的提高，是评估猪群实时健康动态的良好工具。
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猪口腔液在疫病监测上的应用进展一、猪口腔液的介绍
猪口腔液指猪口腔中的唾液和血清渗出液组成的混合液体。唾液是由大小唾液腺（大唾液腺包括腮腺、颌下腺和舌下腺；图1）分泌的混合液体，无色无味近于中性（pH6.6～7.1），其中水分约占99%，其余成分主要是黏液素、淀粉酶、溶菌酶、脂肪酶、富脯氨酸糖蛋白等。血清渗出液是通过口腔黏膜和口腔黏膜上的齿龈沟和毛细血管进入口腔的液体。口腔液具有广泛的生物学功能，口腔液样品可以用于抗体检测和PCR检测抗原，一定程度上可替代血清样品，为监测猪群传染病提供一种新的技术手段。
二、猪口腔液和猪血样作为检测样品的比较
使用口腔液的优势：1.采集方便、成本低廉、效率高、可大量采样；二是采样方法简单，采样人员经简单培训即可，易学易用，可快速获取结果，适合国家性或区域性动物疫病根除或净化计划；三是临床采样简单，可行性强，既不会扰乱猪场日常生产性安排和引发动物不良应激，且可连续采样，尤其适用于富含脂肪组织和生性凶猛的生产公猪群。第四，更符合动物福利原则。
三、猪口腔液可作为评估猪应激情况和健康状况的的生物标记物
口腔液是研究猪应激的最佳液体样品，其中的皮质醇可以作为评估猪应激的标记物。猪群运输、不同环境、不同饲养条件（如不同饲养密度、不同日粮组成、打耳标、采血等）下，猪口腔液中皮质醇不同。另外，口腔液中IgA、α-淀粉酶活性、IL-18、嗜铬粒蛋白A和急性期蛋白（APP，包括C-反应蛋白、血清淀粉样蛋白A等）含量增减变化，可以用于猪群应激压力的评估。
Gutierrez等通过检测APP、结合珠蛋白、C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A的含量，确定了猪繁殖和呼吸综合征（PRRS）健康猪群和患病猪群的的临界值。Gutierrez等通过对健康猪群和发病猪群口腔液蛋白质组学的比较分析发现，发病猪群口腔液中的脂蛋白、脂蛋白Ⅰ、双头胃蛋白酶抑制剂、腺甙脱氨酶、结合珠蛋白、S100-A12、S100-A8、S100-A9和α-淀粉酶的含量显著高于健康猪群。
四、猪口腔液的采集
因为猪舍环境条件和检测目标等的不同，猪口腔液的采集方法会有一定差异，同时采集方法、器械、地点和时间等会影响口腔液的组成成分。在此推荐一种猪口腔液的采集方法：将直径1.3cm的全棉绳用于保育猪、直径1.6cm的绳子用于生长育肥猪和生产公母猪口腔液采集，用于采集育成猪口腔液的工具如图2所示，悬挂处应远离饲槽和猪排便区。棉绳上端固定，下垂高度与猪只的肩关节齐平（图3），任猪咀嚼，30min后收取棉绳（图4），刮取和挤压口腔液至自封袋（图5），然后装入EP管或其它容器。一般认为≥1mL为有效采集量。
五、猪口腔液采集注意事项
(1)口腔液检测并非疫病诊断或检测标准程序，仅用于猪群中循环抗体或病原的检测和评估。
(2)单独处理样品，一旦发现抗体或病原，方便回溯研究。
(3)棉绳相较于其它材质绳吸收性最好。
(4)培养猪群啃咬绳子的习惯，方便后续采集。
(5)宜在猪群较为活跃的上午采集样品。
(6)绳子的悬挂高度应与猪肩胛部齐平。
(7)猪有喜新厌旧的心理，已经使用的绳子不宜再用。
六、猪口腔液在猪疾病诊断方面的应用
在兽医领域，1905年，前苏联最早将马的口腔液用于疾病检测（BlakeandTobin,1986）。在猪，1976年Corthier首先将猪口腔液用于猪瘟的检测。近十几年来，国内外动物医学界对猪口腔液的研究报道日渐增多和深化，将为猪口腔液在分析、检测等方面的推广应用提供良好的前景。
病毒：猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪德尔塔冠状病毒、猪呼吸道冠状病毒、猪繁殖和呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、猪伪狂犬病病毒、A型流感病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、细环病毒1型和2型等的抗体或抗原。
细菌或支原体：猪大肠杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、猪空肠弯曲菌、链球菌、螺旋菌、丹毒丝菌属、胞内劳森氏菌、猪鼻支原体、猪滑液支原体、猪肺炎支原体等的抗体或抗原。
猪口腔液可以用于早期诊断，某些猪传染病的病毒血症在感染猪出现临床症状前已经存在于猪口腔液中，因此可以比血清样品更早得到结果。
口腔液采集样品更方便，如螺旋菌引起的胃溃疡，通常要尸检后方能观察到病变，但可以直接从口腔液中检测到病原。
可以通过口腔液检测一些疫苗的有效性，并可用于对口腔液中病原的分子进化特征进行分析。
猪口腔液在疫病监测上的应用进展猪口腔液(以下简称口液),是指猪口腔中的唾液和血清渗出液的混合液体,具有广泛的生物学功能,既可用作抗体检测,又可用于检测多种病原体,如口蹄疫病毒、非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、圆环病毒2型等。近年来,国内外动物医学界对猪口液的研究日渐增多和深化,口液样本的潜在诊断价值正在被逐步开发利用。
1口液采集方法
在样品采集前应禁食禁水6h,可在早上饲喂前把棉质绳子直接固定在围栏或支架上,绳子的两端与猪的肩胛骨同高,远离水或饲料吸引猪来咀嚼。悬挂时间20min左右,待绳子经过栏舍内所有猪咀嚼后,把绳子放到封口袋内,通过在袋子里拉或挤压绳子,让液体在袋子底部聚集,随后将封口袋一角剪破,将口液收集到15mL离心管内。收集2～3mL口液即可满足检测要求,样品收集后应立即冷藏运输到实验室开展检测。不建议对口液进行过滤除菌、添加抗生素等前处理,可1000～8000r/min离心或不进行任何处理即可开展检测。口液样品4℃可以冷藏至少12d,也可在-20℃或更低温度冻存,冻存对抗体检测影响较小。
在规模为1000～2000头猪或40～50个围栏的棚舍里,放置10根绳子即可;30头及以下的猪圈1根绳子即可。在较大的猪圈(100头以上)内,应在不同的区域内悬挂多根绳子,以吸引不同的猪群。因口液取样引发猪应激很小,采集的最佳频次为每周1次,频次可根据场内疫病发生风险和疫病监测实际情况进行适当调整。
2口液样品优势
目前猪场多通过血液检测疫病的抗体和病原的方法开展猪群免疫监测和疫病诊断,但采血引发猪的应激较大,采样耗时费力,并存在一定人员危险(特别是进行种公猪采样时)。采血监测不能满足疫病净化监测的大样本量和频繁采样,且由于许多病原菌(毒)血症时间较短,也不适用于病原检测。
当前,猪群疫病根除和净化已经全面展开,需要监测大量样品的同时,不同的监测阶段和监测项目对检测样品的要求也不一样。新型的无创样本采集方法具备广阔的市场前景和巨大的实用价值。口液样品采集和监测技术具备样本采集方便,对机体造成的应激小,可检测内容丰富,样本内的成分相对稳定、蛋白和脂类含量低等特点。猪对周围的环境充满好奇和兴趣,喜欢咀嚼,利于口液样品的采集。部分猪场对于口液采集会不会造成疫病传播存在疑虑,因为集体饲养的猪一直在共用喂食器、饮水器、生活区等,所以口液采集并不会额外造成疫病散播。采集的口液样品还有一个保存优势,就是可以直接冷冻保存,口液中的各种酶类和抗菌物质可以使样品保存更长时间。可以使样品保存更长时间。
总而言之,猪口液的采样和检测为监测猪群传染病提供了一种新型的有效技术手段,适于大样本量频繁采样和病原筛查的活体采样及监测。
3注意事项
3.1绳子的大小和类型
纯棉质的三股绳最适合用于检测。绳子直径至少达到1.2cm,以确保收集到足够的样本量。另外,绳子的材质和大小要统一,不能用不同绳索收集口液或者使用尼龙绳、麻绳,否则会对检测结果造成影响。
3.2放置绳子的部位
绳子的最佳悬挂方式是挂在支架上并伸到栏舍生活区中间,水平高度在猪的肩部即可,这样可以让尽量多的猪都接触到绳子。也可以直接将绳子牢固地系在猪可接触的栏杆上,但注意不要系在水槽或龙头附近,这样会稀释口液样品。
3.3放置区域和数量
选定的样品应该具有充分的代表性,合理分布在棚舍的不同区域,一旦划定了采样区域,就需要对区域进行标识,尽量不要变动,以减少对检测结果的影响。一般每栋小型猪舍用5根绳子,大型猪舍用10根绳子,即可提供足够的相关健康信息,可以观察和识别病原体和抗体的变化。
3.4不同生产阶段猪口液的收集
保育猪和育肥猪要注意绳子悬挂20min后立即收集口液,因为产房和保育舍环境温暖,绳子会干燥。单独饲养的母猪需要在早上喂食前取样,将稀糖水喷在绳子上,可以提高成功率,注意不能把绳子直接泡在糖水里,因为这样会大大稀释采集的口液样品,对后续试验的灵敏度造成影响。断奶仔猪需要提前对棉绳进行适应,否则采样成功率不高。
3.5废弃的样品
每次样品采集会有部分绳子被咬断,如果绳子已经掉在地上,样品必须重新采集。
3.6采样频次
建议每周1次,因为一般猪群感染会在4～5周的时间内发生,采样间隔时间过长不仅会造成信息量偏少,而且疫病感染风险更大。口液取样的好处是简便易行,且少量样本就能对群体的感染或免疫状况有所掌握。
3.7样品运输
不可以直接将绳索送往实验室,因为绳索会在运输过程中迅速干掉,要将口液样品挤出后,用带盖的离心管保存后运输。
3.8样品混合
口液不能进行混样检测,因为混样会对测试灵敏度产生影响。提交足够数量的样本,能很好地反映整个猪舍猪的健康和免疫状况。
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