基因组携带了个体的全部遗传信息，基因测序能够加深对疾病尤其是恶性肿瘤的分子机制理解，在诊断与治疗方面都发挥着重要作用。人类基因组学计划完成后，基因测序技术的发展更加迅猛，在临床实践和基础研究中的应用更加广泛。
基因测序是从1954年Whitfeld等测定多聚核苷酸序列开始的，并在随后的30年里相继诞生了一系列的DNA测序方法，包括加减法、双脱氧核苷酸末端终止法、化学降解法、荧光自动测序技术、杂交测序技术等,这些技术与方法均是在化学降解法及双脱氧核苷酸末端终止法的基础上发展起来的,人们将这些DNA测序技术统称为第一代DNA测序技术。
第一代测序技术自发明以来在生命科学研究领域发挥着重要作用,20世纪90年代,人类基因组计划(humangenomeproject,HGP)的顺利完成就得益于第一代测序技术的成功应用。在过去的几十年，第一代测序技术一直作为基因诊断的标准，在基因病特别是单基因病症病人和各种遗传性酶病如苯丙酮尿症、自毁容貌综合症等其他疾病的诊断上发挥着举足轻重的作用，是最常用的基因测序技术[3]。
第一代测序技术的优点是测序读长长,准确性高；缺点是测序成本高,通量较低,无法满足日益增长的测序要求。
HGP完成后,人们迫切要求对基因突变、甲基化、RNA表达以及蛋白质与核酸相互作用等基因功能进行研究,第一代测序技术在应用及通量上已经不能满足更高的重测序和深度测序的要求,从而需要更高通量的核酸测定手段。在其他相关学科与技术的支持和推动下,边合成边测序的第二代测序技术应运而生。
二代测序一次能对几十万甚至几百万条DNA序列进行同时测定,使转录组测序及基因组深度测序变得高效、便捷,在保持高准确性的同时降低了测序成本,提高了测序的速度。
21世纪以来,为了实现对一条DNA分子进行单独测序,并克服第二代测序技术中读长较短的缺点,科学工作者开发出以单分子DNA测序和纳米孔测序为标志的第三代测序技术。
单分子DNA测序是当荧光标记的脱氧核苷酸与DNA链形成化学键的时候,它的荧光基团就被DNA聚合酶切除,荧光消失,再利用显微镜实时观测荧光的强度变化来实现序列的测定。纳米孔测序是利用电泳来驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现的,根据不同碱基穿过时电导的微小改变，通过电信号的差异,检测通过的碱基类别来实现测序。
第三代测序技术可以直接检测RNA序列及DNA甲基化序列,由于其测序速度快,无需聚合酶链式反应(PCR),避免了覆盖度不均一和PCR假象,且准确性高,同时仪器设备相对便宜及操作较简单,
所以在单细胞水平上寻求信息变异、细胞异质性、表观遗传、胚胎植入前遗传学诊断(PGD)、肿瘤细胞的演化等领域的研究与应用前景广阔。其代表是单分子测序平台(tSMS)、单分子实时合成(SMRT)技术测序平台、基于荧光共振能量传递(FRET)技术测序平台与纳米孔单分子技术测序平台。
随着测序技术的不断发展,其应用领域也在逐渐扩展,该技术对遗传性疾病的研究与诊断显得尤为重要,在人类已知的疾病中,有4000多种疾病与基因异常有关,利用全基因组测序技术在全基因组水平上检测与人类疾病相关的单核苷酸变异(SNVs)、插入缺失(InDels)、拷贝数变异(CNV)、结构变异(SV)、RNA表达差异、甲基化异常等突变信息,进而找到致病突变并研发出有效的治疗药物,为临床诊断及人类健康提供帮助。
测序技术的发展历程及最新技术的应用技术发展历程最新摘要：通过DNA测序不仅可以更好地认识生命的本质,了解生物的差异性、进化及发展史,而且为重组DNA的研究提供了方向,在疾病诊断及基因分型方面具有非常重要的实用价值。首先从发现DNA是遗传物质开始,简要回顾了第一、二和三代测序技术的整个发展历程,以及各自的优缺点和主要测序技术或平台;其次,重点介绍了由PacBio公司开发的第三代测序典型技术——单分子实时测序技术(SMRT)和ONT纳米孔测序技术的原理、方法和技术流程,并总结了第三代测序技术的应用领域,包括基因组重测序、donovo测序、转录组研究、甲基化检测、与疾病相关的结构变异检测,以及流行病学中病毒准种分析等应用;再次,比较了三代测序技术在转录组测序和表观遗传学研究中的技术优势,第三代测序技术在基因组重复区域或结构变异等研究领域具有非常明显的优势,对多种疾病的研究意义重大,已成为未来重要的精准诊断工具,此外,凭借对重要经济物种遗传信息的解析,育种工作者通过建立基因与性状的关联,对持有优良性状基因的个体进行人工选育,大大缩短了育种年限;最后,对第三代测序技术在医疗、农业、环境等领域的应用前景进行了展望。
关键词：第三代测序;单分子测序;长读长;结构变异;
Abstract：DNAsequencingnotonlyhelpsusbettertounderstandthenatureoflife,biologicaldifferences,differentbiologicalevolutionsanddevelopmentalhistoryoforganisms,butalsoprovidesdirectionforrecombinantDNAresearch,andhasveryimportantpracticalvalueindiseasediagnosisandgenotyping.Firstly,fromthediscoverythatDNAisageneticmaterial,webrieflyreviewtheentiredevelopmentprocessofthefirst,secondandthirdgenerationsequencingtechnologies,theirrespectiveadvantagesanddisadvantages,andthemainsequencingtechnologiesorplatformsineach.Secondly,wefocusonthethirdgenerationsequencingtypicaltechnologydevelopedbyPacBio,includingsinglemoleculeRealtime(SMRT),OxfordNanoporeTechnologies(ONT),introducetheprinciples,methodsandtechnicalprocesses,andsummarizetheapplicationareasofthethirdgenerationsequencingtechnology,includingthegenomicresequencing,donovosequencing,transcriptomestudies,methylationtesting,disease-relatedstructuralvariationtestingandtheapplicationofviralquasispeciesanalysisinepidemiology.Thirdly,theadvantagesofthreegenerationsofsequencingtechniquesintranscriptomesequencingandepigeneticsarecompared,thethirdgenerationsequencingtechnologyhasobviousadvantagesinresearchfields,suchasgenomicrepeatregionsorstructuralvariations,andverymeaningfulforthestudyofvariousdiseases,itisconsideredtobeanimportantandaccuratediagnostictoolinthefuture.Inaddition,breederscanartificiallyselectindividualsbyestablishingassociationsbetweengenesandtraitsbyanalyzingthegeneticinformationofimportanteconomicspecies,whichgreatlyshortensthebreedingperiod.Finally,weprospectthefutureapplicationofthethirdgenerationsequencingtechnologyinmedicine,agricultureandenvironment.
Keyword：thethirdgenerationsequencing;singlemoleculesequencing;longreads;structuralvariations;
自1953年Watson和Crick提出DNA分子双螺旋结构以来,对遗传信息的解码一直是生命科学工作者的追求,很多研究者开始了对DNA测序技术的探索。1975年,Sanger发明链终止法,正式开启了一代测序的时代。1990年,人类基因组计划正式启动;20xx年,人类基因组草图绘制完成,生命科学步入基因组学时代。DNA测序技术的发展为人类探索自身和其他生命的奥秘提供了可能,同时,基因组学时代的来临对DNA测序技术也提出了更高的要求,推动了DNA测序技术的不断进步。目前科学研究已进入了高通量测序时代,从单一、局部的基因或基因片段的研究转变成了对整个基因组的研究,在基因组从头测序和转录组测序中应用较广。近几年来,以单分子实时测序为代表的第三代测序技术开始进入人们的视野,该测序技术跨越了一、二代较短读长而直接对DNA单个分子进行测序的新一代测序平台应用日益广泛。作者简要回顾了第一、二和三代测序技术的整个发展历程、各自的优缺点及主要测序技术或平台,重点介绍了由PacBio公司开发的第三代测序典型技术原理、方法和技术流程,并总结了第三代测序技术的应用领域,对第三代测序技术在医疗、农业、环境等领域的应用前景进行了展望。
1、测序技术的发展历程
1.1、一代测序
测序技术的发展历程及最新技术的应用技术发展历程最新DNA序列分析在现代生物学和生命科学中扮演着重要的角色。人类基因组计划极大地加速了DNA片段分析技术的发展。自动化、高速、高通量成为新一代DNA片段分析仪的基本要求。DNA测序技术是现代分子生物学研究中最常用的技术，从1977年第一代测序技术的出现，经过30多年的发展,DNA测序技术取得重大进展，以高通量为特点的第二代测序技术逐步成熟并商业化,以单分子测序为特点的第三代测序技术也已经出现。本文介绍每一代测序技术的特点，并重点介绍了第二代测序技术及其应用。展望新的测序技术对于未来生物学研究及人们自身健康与人类疾病等方面研究的影响。
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