摘要：目的研究D-氨基葡糖盐酸盐（GAH）的抗肿瘤作用。方法用SRB法观察GAH的体外抗肿瘤作用，通过GAH对S180，H22荷瘤小鼠瘤重和生存时间的影响，观察 GAH的体内抗肿瘤作用。结果GAH可明显抑制S180小鼠瘤体的生长，明显延长H22荷瘤小鼠的生存时间；对3种人癌细胞（HepG-2，LS-174，BGC-7901）具有一定的杀伤作用，以对HepG-2细胞的抑制作用较为明显。结论GAH于实验条件下在体内外均有一定的抗肿瘤作用。
关键词：D-氨基葡糖盐酸盐；抗肿瘤作用
中图分类号：R979.1文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)02-0008-03
Study on Antitumor Effect of D-Glucosamine Hydrochloride in Vitro and in Vivo
XU Hai-jiao1, CAO Xiu-ming1、2, JI Yu-bin1, LI Hui1
Abstract：Objective To study the antitumor activity of D-glucosamine hydrochloride(GAH). Methods The antitumor activity in vitro was observed by SRB, and the effect in vivo was studied by observing tumor weight and survival time of S180 and H22 mice. Results GAH was a powerful antitumor agent in 3 kinds of human cancer cell lines(HepG-2、LS-174、BGC-7901), especially HepG-2. GAH also inhibited the growth of cancer cells of S180 mice and prolonged the survival time of H22 mice. Conclusion GAH has a relative high potent antitumor effect both in vitro and in vivo.
Key words：D-glucosamine hydrochloride; antitumor activity
D-氨基葡糖盐酸盐又称葡糖胺盐酸盐（D-glucosamine hydrochloride，GAH），化学名2-氨基-2-脱氧-D-葡糖盐酸盐，其结构为D-葡糖分子中C2-羟基被氨基取代，因氨基显碱性，与盐酸成盐[1, 2]。目前，GAH抑制癌细胞及肿瘤细胞生长等作用的研究日益受到重视。本研究围绕GAH的体内、外抗肿瘤作用展开，以冀为本品的深入研究及应用提供实验基础。
1材料
1.1肿瘤细胞系和瘤株
人肝癌细胞（HepG-2）、肠癌细胞（LS-174）、胃癌细胞（BGC-7901）、小鼠肉瘤（S180）、小鼠肝癌（H22）（哈尔滨医科大学肿瘤防治所提供）。
1.2动物
昆明种小鼠（黑龙江省肿瘤防治研究所提供，体重20±2.0g，雄性。合格证号：黑动字P4）。
1.3主要试剂与仪器
GAH（中国海洋大学刘万顺教授惠赠）；小牛血清、RPMI-1640培养液（Gibco）；SRB（Sigma）；5-氟尿嘧啶（5-FU，上海海普制药厂）；环磷酰胺（CTX，江苏恒瑞医药股份有限公司）；LNA-Ⅲ型二氧化碳培养箱（日本）；EL311型酶标仪（美国BIO-TEK公司）。
2方法
2.1体外抗肿瘤作用
SRB法检测GAH体外细胞毒。SRB法为一种细胞毒实验，以检测培养细胞的蛋白质来确定细胞生长和存活情况。本实验通过SRB法检测GAH体外对HEPG-2，BGC-7901，LS-174细胞的抑制作用[3]。
实验所用细胞于含5% CO2的37 ℃培养箱中培养传代，用含10%胎牛血清及100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的RMPI 1640培养液培养；用0.25% 胰酶消化传代，每3~4 d换培养基1次，待细胞长满及时传代。
将对数生长期的细胞经0.25% 胰酶消化分散后计数制成细胞悬液，细胞浓度调至1×104个/mL，接种于96孔板，100 μL /孔。培养箱中培养24 h后, 每孔加入GAH 100 μL（终浓度分别为0.05，0.1，0.2，0.4 mg/mL）；同时设空白对照孔（每孔加RPMI-1640培养液100 μL）；阳性对照组（每孔加5-FU 100 μL，终浓度为0.2 mg/mL）。每个剂量设6个平行孔，继续培养。48 h后取出培养板，每孔加50 μL预冷的50%的TCA固定细胞（TCA终浓度10%），静置5 min，用去离子水洗4~5次，空气干燥。每孔加0.4% SRB溶液100 μL，室温放置 30 min，弃去液体，用1%醋酸轻洗4~5次，甩干。加10 mmol/L非缓冲三羟甲基胺基甲烷碱液（Tris）200 μL，稳定10 min后用酶标仪检测各孔吸光度A值（570 nm）[4]。
抑瘤率＝(1－用药孔A值/空白对照孔A值)×100%
2.2体内抗肿瘤作用
2.2.1GAH对S180小鼠瘤重的影响取18~22 g昆明种小鼠接种S180瘤株，方法[5]是在无菌条件下抽取接种7 d并生长良好的S180荷瘤小鼠腹水，用灭菌生理盐水1:3稀释，分别将0.2 mL稀释液接种于每只小鼠右腋下。接种后次日称重，随机将小鼠分为4组，即阴性对照组（生理盐水组），阳性对照组（环磷酰胺组，灌胃25 mg/kg），及GAH低、中、高剂量组（分别灌胃30，60，120 mg/kg的GAH生理盐水溶液）。每日灌胃1次，每次每只小鼠0.2 mL。连续7 d，于第8日称重，处死，分别取肿瘤和脾脏，称重，并按下列公式计算肿瘤生长抑制率以及脾脏指数（实验重复3次）。
2.2.2GAH对H22小鼠生存时间的影响为昆明种小鼠移植肿瘤细胞 [5]，取接种7 d生长良好的H22小鼠，无菌条件下抽取腹水，在冰浴条件下用灭菌生理盐水1:3稀释，分别将0.2 mL稀释液接种于昆明种小鼠腹腔内。24 h后称重，随机分组，分组与给药同2.2.1，停药后观察记录各组小鼠的死亡数。各组小鼠全部死亡后，计算生命延长率（实验重复3次）。
2.3统计学处理
用SPSS11.5软件处理，各组数据以 表示，组间比较用t检验。
3实验结果
3.1GAH体外抗肿瘤作用
3.1.1对人肿瘤细胞的抑制作用见表1。由表1 可见，GAH对HepG-2细胞有一定的抑制作用，0.2 mg/mL浓度的GAH抑瘤率最大，为42.4%，对LS-174、SGC-7901抑制作用较弱，最大抑制率分别为28.7%和24.2%。
表1 GAH对人肿瘤细胞的抑制作用（SRB法）
*P＜0.05，**P<0.01 vs空白对照组
3.2GAH体内抗肿瘤作用
3.2.1对S180小鼠瘤重和脾脏指数的影响见表2。由表2可见，GAH高、中、低各剂量组小鼠的瘤重均明显低于生理盐水组，呈现剂量依赖性，以高剂量组效果最好（P<0.01）。GAH各组脾脏指数与生理盐水组比较无显著差异，而环磷酰胺组脾脏指数与生理盐水组比较有统计学意义 （P<0.05）。此外，GAH 3个剂量组的小鼠体重与生理盐水对照组相比均明显增加（P<0.05），环磷酰胺组与对照组比较，体重明显减轻（P<0.01）。
表2 GAH对S180小鼠瘤重和脾脏指数的影响
*P<0.05，**P<0.01 vs生理盐水组
3.2.2对H22小鼠生存时间的影响见表3。GAH有显著延长 H22小鼠生存时间的作用，剂量与效果呈正相关，且高剂量组小鼠的生命延长率与环磷酰胺组相当。
表3 GAH对H22小鼠生存时间的影响
**P<0.01 vs生理盐水组
3讨论
H22，S180，HEPG-2，SGC-7901，LS-174均为抗肿瘤药物筛选实验中常用的肿瘤模型，我们用以上瘤株进行了GAH的体内外抗肿瘤作用实验。实验结果表明，GAH体外对HEPG-2细胞生长有一定的抑制作用，但对SGC-7901，LS-174的抑瘤效果不明显。GAH具有较强的体内抗肿瘤作用，能显著抑制S180的增长，且剂量与效果呈正相关，各剂量组结果均有统计学意义，GAH高中低剂量均明显地增加了H22腹水瘤小鼠的生命延长率。且GAH对荷瘤小鼠的脾脏指数无影响，环磷酰胺则使小鼠脾脏指数明显下降。此外，经给药期间观察，GAH各组小鼠食欲较好，精神状态佳，体重明显增加，阳性药环磷酰胺组则多数出现腹泻、食欲下降、精神差、体重降低等症状，GAH各组小鼠生存质量明显优于环磷酰胺组。推测GAH的抗肿瘤作用机制可能是通过提高机体免疫功能体现的，而非直接杀伤肿瘤细胞，其具体抗肿瘤机制有待进一步实验研究。
参考文献
[1]李南，李继珩．D-氨基葡萄糖盐酸盐的制备研究[J]．中国药科大学学报，1997，28（1）：56-58．
[2]杨建平，童兴龙，胡爱珠．氨基葡萄糖盐酸盐的研制[J]．海洋通报，1999，18（3）：77-81．
[3]魏一生，金静君，何萍，等．SRB试验最适工作条件探讨[J]．福建医药杂志，1998，20：（２）：92-94．
[4]孙丽媛，邵世和．SRB法检测亚硒酸钠对SGC-7901细胞生长的影响[J]．北华大学学报（自然科学版）2004，5（２）：122-124．
[5]徐叔云，卞如濂，陈修．药理实验方法学[M]．第2版．北京：人民卫生出版社，1991：1208-1210．
注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”
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