真菌诱导子对菊苣发状根培养中香豆素的产生和增长的影响
一、介绍：
植物细胞和器官培养系统为具有商业价值的食品和制药行业的植物次生代谢物提供一个可用的选择。须根系统的不同组织具有生物合成的功能，且比细胞培养的生长率要高得多.这种独特的化合物为在可控的生物反应器产生的植物化学物质中不可测定的术语里提供了潜在的可能性。在诱导子领域的发展已为次生代谢产物打开了一个新的前景。使用诱导子来增加次生代谢产物已经被进行广泛的调查研究。
另外一种增加菊苣须根培养次生代谢产物的途径已经被报道，进一步观察得知，外源输送的多胺使根增长以及促进了香兰素的形成。
针对诱导子和感染，在植物中多胺的积累已被报道在土豆茎段培养中有所应用。将马铃薯晚疫病菌作为诱导子的使用已经被报道可以增加体外繁殖马铃薯茎段培养中总内源多胺的含量。同样也报道了多胺滴度会增加对病原体的攻击，特别是真菌攻击。众所周知，多胺的生物合成和浓度可以促进植物肿瘤和须根培养。在最近的几项研究表明，多胺在真菌诱导子的作用下，可能参与了植物应对病原体的感染过程。此外，一些简单的研究已经发现腐胺或是其他多胺可能是菊苣中香兰素合成的底物。
七叶苷元在化妆品和七叶灵中被广泛当做一个紫外线过滤器，且在媒体生物中作为标记使用。本调查旨在研究在菊苣须根生长中真菌诱导子和在须根培养中6羟基香豆素，6葡萄糖苷的形成对植物生长的影响。我们也检查了在真菌诱导须根培养中总内源多胺的量。由于真菌诱导子处理产生形态的差异也进行了调查。这将有助于理解在须根培养的特定形态反应中诱导子的作用。
这种与香兰素的产生和菊苣的须根培养中多胺代谢改变中的真菌诱导子相关的方法是第一次尝试。因为在这项研究中使用的两种真菌菌株是造成大田菊苣作物栽培重大损失的真菌类型，并且在作物储存的过程中，它被作为攻击的病原体。这被设想为，尽可能使用这两种真菌诱导子在受控条件下为这些须根提供压力，从而获得高速的代谢物生产。
二、材料与方法：
植物材料：从研究中心获得的来自于十株菊苣植物的种子。
培养条件：种子要用百分之5到20的清水进行表面消毒15分钟，之后用百分之70的酒精消毒5秒，随后用百分之5的次氯酸钠消毒10分钟。MS培养基用百分之三的蔗糖，和百分之0.8的琼脂，用高温灭菌锅在121摄氏度，1.06千克每平方厘米的压力下灭菌十五分钟。进行表面消毒完的种子被接种在培养基上，培养温度为23-27度，并在冷光照射下，白天光照16小时，晚上黑暗处理8小时进行循环照射。
须根的诱导：须根生长开始于接种了四周，在土壤杆菌诱导下的受伤幼苗的茎。 细菌群体接种在固体培养基之前，要与苗进行相同的条件下的处理，培养三天。再被细菌侵染之后的8-12天，根会发生变形。拿出大约3cm长的须根并立即接入配有40毫升的MS培养基的每个150毫升装有每升500毫克的羧苄青霉素烧瓶中。在包含有抗生素的液体基础培养基中的须根要每隔3天 进行次代培养。随后，将须根转移到MS液体基础培养基上，在23-27摄氏度，黑暗的条件下，以90rpm的转速做震荡培养以获得无菌的毛状根。将无菌的须根进行筛选，之后培养在接种了一块存有土壤杆菌的约50毫克的外植体上，并且分别接种在1毫升的液体培养基上，每个 处理温度为37摄氏度，培养时间为48小时。这些无菌的须根并不能显示在测试的条件下出现被土壤杆菌影响的现象。每次试验的接种量大概在100毫克左右。每隔一段时间，须根就会生长出来，且根垫部位要用无菌蒸馏水清洗两次。将叠好双层滤纸之后，培养出的须根鲜
重要以克为单位进行记录。增长指数是计算须根从鲜重初始到培养结束的周期的差异比，所以，要培养28天。要重复做三次诱导子实验，每个真菌处理要有五次重复，且记录平均值。
内源多胺的提取：
在经过高氯酸和高氯酸不溶提取物提取内源多胺之后，通过 方法进行苯甲酰氯处理来测定多胺。五次实验，鲜重组织的平均值要以每克纳摩尔的方式来表达。
诱导子的准备和添加：
将烟草黑胫病菌和瓜果腐霉菌两种真菌接种到含有50毫升土豆培养基的250毫升的烧瓶中，并在室温下进行培养。培养基中使用200克切碎块的土豆，并将其在大约200毫升的蒸馏水中煮沸。随后经过四层纱布进行提取，对此，加入20克的葡萄糖，定容到1升。培养基的PH要调到6.5，并含有10%的酒石酸。在20天的稳定期之后，对真菌进行灭菌，且菌垫要分别进行过滤。随后，菌垫要用蒸馏水清洗几次，将提取物在研钵上用酸洗砂均匀研磨。提取要用棉布过滤，且提取量要与的滤液相同。菌丝体的提取液和滤液要在使用前经过高压灭菌锅进行灭菌。
菌丝体提取是从在100ml的MS基础培养基上，经高温高压处理，并分别称取0.5，1，3克的湿润菌丝体组织中提取获得的。因此，使用的梯度分别是0.5%，1.0%，3.0%w/v。媒质滤液也做0.5%，1.0%，3.0%w/v处理。滤液用于补充维持培养液。对在菊苣生长和香豆素生产中MF和ME的影响的时间进程研究，要控制在每隔7天到四周的时间内收获。
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